Radical phosphate transfer mechanism for the thiamin diphosphate- and FAD-dependent pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum. Kinetic coupling of intercofactor electron transfer with phosphate transfer to acetyl-thiamin diphosphate via a transient FAD semiquinone/hydroxyethyl-ThDP radical pair.

El difosfato de tiamina (ThDP) - y flavina adenina dinucleótido (FAD) que dependen de oxidasa piruvato a partir de Lactobacillus plantarum cataliza la conversión de piruvato, fosfato inorgánico, y el oxígeno a acetil-fosfato, dióxido de carbono, y peróxido de hidrógeno. Central a la secuencia catalítica, dos equivalentes de reducción se transfieren desde las formas carbanión / enamina resonantes de alfa-hidroxietil-ThDP al cofactor de flavina adyacente en una distancia de aproximadamente 7 A, seguido por la fosforolisis de la formado de este modo acetil-ThDP. La cinética de estado Pre-estable y de estado estacionario utilizando espectroscopia resuelta en el tiempo y un análisis intermedio basado en RMN 1H indican que ambos procesos están acoplados cinéticamente. En presencia de fosfato, intercofactor electrones de transferencia (ET) procede con una constante de velocidad de primer orden aparente de 78 s (-1) y está cinéticamente cerrada por la formación anterior del aducto tetraédrico sustrato ThDP 2-lactil-ThDP y su descarboxilación. No transitoria flavina radicales son detectables en el medio-reacción reductora. En contraste, cuando el fosfato está ausente, ET se produce en dos pasos discretos con constantes de velocidad aparentes de 81 y 3 s (-1) y la formación transitoria de un par radical flavina semiquinona / hidroxietil-ThDP. Análisis de dependencia de la temperatura de acuerdo con la teoría de Marcus identifica el segundo paso, el decaimiento radical lento para ser una verdadera reacción ET. Los potenciales redox de la FAD (ox) / FAD (sq) (E1 = -37 mV) y FAD (sq) / FAD (rojo) (E2 = -87 mV) pares redox en ausencia y en presencia de fosfato son idénticos. Tanto el análisis de resonancia de fluorescencia y transferencia de energía de los estudios utilizando el Marcus fluorescente N3'-piridil-ThDP indican la misma distancia cofactor en presencia o ausencia de fosfato. Deducimos que el exclusivo 10 (2) -10 (3) aumento de la velocidad -fold de la segunda etapa ET es más bien debido al ataque nucleofílico del fosfato sobre la resultante radical hidroxietil-ThDP cinéticamente estabilizado en un aducto radical bajo potencial de aniones que fosfato en un sitio de acoplamiento ser parte de una vía de ET-a través de servidumbre en un mecanismo de paso a paso de ET y fosforolisis. Por lo tanto, LpPOX constituiría el primer ejemplo de un mecanismo de fosforolisis-radical basado en bioquímica.